Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN

 

 

Este es un método usado aún por varios laboratorios para la determinación de paternidad por ADN. Sin embargo, es un método antiguo y - en la práctica - es tecnológicamente obsoleto. Hoy en día el método más preciso y exacto es el Método STR el cual es el usado por BioGenomica.

Para efectos de información histórica pasamos a describir sucintamente el método RFLP:       

1) El ADN es extraído de los glóbulos blancos (leucocitos) de la sangre.
      
2) El ADN de la muestra es cortado en fragmentos, los que resultan ser de tamaños diversos, precisamente porque estos tamaños dependen de la diversidad y variabilidad genética de la muestra. El nombre RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) significa que se usa la propiedad de ciertas enzimas llamadas de restricción para cortar regiones específicas del ADN que sucede que son muy variables (hipervariables) de individuo a individuo (polimorfismo).

     
3) Los fragmentos de ADN son colocados en una superficie gelatinosa (gel de agarosa) con el propósito de someterlos a una separación en base a su diferente tamaño.

      
4) Se sumerge el gel en una solución conductora y luego se aplica una corriente eléctrica a lo largo del gel. A este proceso se le llama electroforesis.

        
5) Puesto que el gel (hecho de agarosa) tiene poros, los fragmentos más pequeños de ADN migrarán hacia el ánodo (polo positivo) más rápidamente que los fragmentos de ADN que sean más largos.

        
6) Los fragmentos de ADN así separados se transfieren luego por adhesividad a una membrana de nylon. A este proceso se le conoce como Southern blotting.

         
7) La membrana de nylon contiene ahora covalente y firmemente adheridos los fragmentos de ADN en la misma posición en que migraron sobre el gel durante el proceso de electroforesis.

          
8) Esta membrana de nylon es expuesta a sondas marcadas de ADN. Estas sondas son pequeños fragmentos sintéticos de ADN de secuencia conocida y que corresponden a zonas selectas de hipervariabilidad del ADN humano. Las sondas suelen estar marcadas con isótopos radiactivos o con sustancias fluorescentes (por tanto, emisoras de luz).

         
9) La membrana de nylon luego se coloca contra una película de rayos X (si se usó sondas radiactivas) o fotográfica (si se usó sondas fluorescentes), la cual luego es revelada.

            
10) Las bandas que se observan en la película revelada son típicamente así:

                               Madre                   Hijo(a)              Padre Supuesto #1      Padre Supuesto #2

                                                                                    

                                                                                    

                                                                                    

                                                                                    

                                                                                    

                                                                                    

 

En este ejemplo, el padre supuesto # 1 es el verdadero padre. A esto se le llama inclusión y a esta prueba se le asigna un Índice de Paternidad (PI) el cual se cuantifica tomando en cuenta la probabilidad (ya conocida por estudios horizontales en grupos raciales definidos) de que un fragmento (alelo) de tal tamaño aparezca en un individuo cualquiera.
       

11) El proceso se repite varias veces usando la misma membrana de nylon, pero exponiéndola a diversas sondas. Cada sonda identifica áreas diferentes del ADN (que mapean en regiones diferentes de diferentes cromosomas).
   

12) Los diferentes Índices de Paternidad se multiplican entre sí (pues estadísticamente se trata de eventos que ocurren independientemente) para así calcular el llamado Índice de Paternidad Combinado (CPI).
  

13) En base al CPI, se aplica la siguiente fórmula para calcular la Probabilidad de Paternidad (PP):

PP = 1 – CPI/(CPI-1)

 

                                                                 

                                                                 

                                                                 

                                                                

 

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